Las semillas presentan muchas morfologías, los granos son un tipo de semilla que presentan testa dura y de apariencia seca, son semillas consideradas como ortodoxas, tolerantes o resistentes  a la deshidratación y permiten su almacenamiento por tiempos largos.

Los granos son tambien el resultado de la domesticación de varias especies que hoy sirven  de alimento para la humanidad y es en este grupo de semillas que se encuentran varias especies de leguminosas como la soja, el frijol, alfalfa, chícharos, garbanzos, lentejas  y varias especies de cereales como lo son el maíz, trigo, cebada, arroz centeno, sorgo, avena, amaranto.    

Las semillas ortodoxas al madurar toleran un bajo contenido de humedad lo que fascilita su almacenmaiento  y este puede llegar a tener entre un 3 a un 8% de humedad, manteniendo su viabilidad.  

La viabilidad de las semillas, mantiene la capacidad de que las semillas germinen, formen plántulas en condiciones favorables para su crecimiento y desarrollo.  La viabilidad se puede determimar mediante la germinación de una muestra de semillas, esto se logra colocándolas en un ambiente controlado que le proporcione las condiciones óptimas para su germinación.  La ISTA, (International Seed Testing Association) contempla algunos de los aspectos necesarios para la germinación de varias especies (Moreno Alvarez, et al., 2001).  La germinación es considerada como la mejor prueba de viabilidad de una semilla.

Se considera que una semilla ha germinado al iniciarse el crecimiento del embrión  que utiliza el alimento almacenado en el endospermo de la semilla, es considerado como un proceso fisiológico de gran importancia para la reproducción de las especies y que culmina con la emergencia  de la radícula junto  con elompimiento de la testa de la semilla, para iniciar la formación de una plántula que vivirá por si misma, al realizar el proceso de la fotosíntesis con su clorofila y realizar su propio alimento. Este proceso se encuentra influenciado por factores internos de la semilla, así como por factores externos considerados como abióticos,  este proceso se inicia con el proceso de imbibición de la semilla que es cuando la semilla absorve agua para activar su metabolismo.
La germinación permite la observación de la viabilidad de la semilla de manera directa pero requiere de tiempo, y que las condiciones necesarias de luz temperatura y humedad alcancen el nivel apropiado para que ocurra, que en ocasiones no hay posibilidades de esperar por lo que es necesario aplicar otras técnicas para la detección de la viabilidad.  Es así que la prueba conocida como prueba de Lakón esapropiada y de rápida detección, diseñada por Lakón en 1942.

La Prueba de Lakon, denominada como la “vitalidad de la semilla”se basa en la coloración de los tejidos vivos y con una muestra topográfica marcada por la sal de cloruro 2, 3,5-trifenil tetrazolio.  Es así como se realiza la evaluación de la viabilidad de las semillas, las células son teñidas cuando el tejido se mantiene vivo.  Una vez teñido se realiza una topografía de la semilla marcando la localización y observacipon de los tejidos de la semilla teñidos y para ello requiere que el tejido reaccione por la actividad metabólica que éste realice, algunas de las semillas han sido registradas en el libro de la ISTA  (Hampton y Tekrony, 1995).

El tetrazolio reacciona una vez que la semilla fue imbibida y que se activó su metabolismo celular, su actividad fisiológica y su respiración lo que hace que el tetrazolio reaccione con las céluas vivas haciendo que éstas se tiñan de color rojo y no se tiñen aquellas que se encuentran muertas, evaluando así la viabilidad de la semilla, así como su vigor. Con ello se pueden expresar los resultados en base a % de semillas viables, aquellas mayormente teñidas con respecto a las semillas no viables o no teñidas. La prueba de tetrazolio fue determinada como la segunda prueba más precisa después de la prueba de germinación.

La solución de tetrazollio se difunde a través de los tejidos de la semilla desde la testa, hacia el interior de su endospermo y embrión,  que debe ser previamente hidratada para permitir  ablandar los tejidos y que la solución penetre, cuando hay dificultad se recomienda el uso de tween 20 como un surfactante.  Al difundir hacia el interior de la semilla el tetrazolio se reduce por la presencia de enzimas deshidrogenasas (enzimas de la respiratción) que se incementan con la actividad liberando iones de hidrógeno que reducen la solución del  cloruro 2,3,5 trifenil tetrazolio que es incoloro a la formación de un compuesto insoluble de color rojo llamada formazan.  Este formazan tiñe las células vivas de rojo, indica ndo la actividad respiratoria de las mitocondrias e indicando que las células de la semilla se encuentran viables e indicando así mismo, la calidad de la semilla.  La intensidad de la coloración indica la capacidad que tendrá la semilla para germinar y producir una plántula normal, aunque ésta puede presentarse en estado de latencia y no germinar de inmediato.
La prueba de tetrazolio se ha convertido en una rápida evaluación del vigor de las semillas viables y ha sido aceptada y probada para varias especies comerciales de granos y se ha extendido para otras especies silvestres como es el caso de semillas de orquídeas y bromélias que también presentan un interés comercial, indicando si las semillas se encuentran vivas y si éstas podrían germinar. Con los años desde su descubrimiento en 1942, la prueba de tetrazolio ha probado ser la prueba más precisa y con una alta repetibilidad y que además determina el vigor de la semilla.

La sal de tetrazolio ha sido empleado para resolver otros problemas de viabilidad tanto en animales como en plantas, ha sido utilizado para determinar la habilidad de la germinación de semilla, principalmente de cereal, para determinar el daño por congelamiento de las plantas durante el periódo de crecimiento en campo, para estimar el daño en cacahuates, la viabilidad de hongos y bacterias, la viabilidad de polen(Viéitez Cortizo,1952).
El tetrazolio se utiliza en dosis del 1 y 2 % de concentración, que son concentraciones que han sido utilizadas para diferentes titpos de granos éstas combindas con diferentes temeraturas de 20, 30, 40 50 50 60 70 y 80°C, optimizando su eficacio entre los 40 y 50 °C para acelerar su actividad (Viéitez Cortizo, 1952), de ahí muchos trabajos de investigación han sido realizados cambiando las concentraciones del tetrazolio así como las temperaturas ( Buendía et al., 2012).
Con el uso del tetrazolio se evidencia la condición fisiológica de las semillas que pueden ser registrada como una imagen topográfica de éstas  y obtener así el registro de su calidad de vigor y viabillidad (Moore, 1985; Cravioto et al., 2008).

Conclusiones

La prueba  de tetrazolio es un método apropiado para conocer rápidamente potencial del vigor, viabilidad y capacidad germinativa de un lote de semillas, en unos cuantos minutos,  ofreciendo una alternativa rápida para su  evaluación sin la necesidd de esperar varios días para que la semilla germine.   Es necesario que se realicen pruebas preliminares para cada especie de  semillas, a fin de  conocer que concentración del tetrazolio puede determinar su efecto para obtener las topografias de las semillas pertinentes. Aunque no debemos olvidar que la mejor prueba de viabilidad de una semilla es su germinación.

REFERENCIAS

Buendía López, Y.O., Izquierdo Santos L.L., Méndez Flores J.E., Serrano, H., García Suárez, M.D. 2012. Prueba de Lakon en semillas de tres especies del género Laelia (Orchidaceae) y un híbrido con 26 años de almacenamiento.   V Congreso Mexicano de Cactáceas y Suculentas.  Juriquilla, Qro. Noviembre 19 –22. 2012.

Craviotto, R.M.; Arango Perearnau, M.R.; Gallo, C. 2008. Prueba Topográfica por Tetrazolio en soja. Suplemento Especial. Análisis de Semillas. ISSN. 1851-9615. Año 2008. Nº 1. 96 pp

García-Suárez, M .D., Rico-Gray, V., Molina Aceves, N.  y Serrano, H. 2006.    In vitro  germination and clonal propagation of the endemic Tillandsia califanii Rauh (Bromeliaceae) from México.  Selbyana 27(1): 54-59.

Hampton, J. y D. Tekrony. 1995. Handbook of vigour test methods. International Seed Testing Association. Zürich, 117 pp.

Lakon, G. 1942. Topographischer Nachweis der Keimfahigkeit der Getreidefruchte durch Tetrazoliumsalze. Ber. Dtsch. Bot.Ges. 60, 299-305.

Moreno-Álvarez, M.; L. Benito-Matías; N. Herrero; S. Domínguez y J. Peñuelas. 2001. Estudio de nuevos métodos de determinación de la viabilidad de las semillas forestales: Test de electroconductividad e índigo carmín. Comparación con el test del tetrazolio y su aplicación a Pinus pinaster y Pinus halepensis. Actas del III Congreso Forestal Español, Mesa 3, pp. 653-658.
Viéitez Cortizo,E. 1952. El uso del cloruro 2, 3, 5-trifeniltetrazolium para determinar la vitalidad del polen. Anales de edafología y fisiología vegetal 12 (12): 1033-1044 (1952
    
Dra. Ma. Dolores García Suárez. Departamento de Biología, Laboratorio de Micropropagación y Propagación Vegetal. Universidad Autónoma Metropolitana Iztapalapa.

Dr.Héctor Serrano. Departamento de Ciencias de la Salud, Laboratorio de Biología Moleculary Regulación endócrina.  Universidad Autónoma Metropolitana Iztapalapa.

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